科罗拉多大学 | 诱导多能干细胞（iPSC) 在皮肤科中的应用

本文作者Ganna Bilousova and Dennis R. Roop来自科罗拉多大学安舒茨医学院皮肤科，原文标题为Induced Pluripotent Stem Cells in Dermatology: Potentials, Advances, and Limitations（皮肤病学中的诱导多能干细胞：潜力、进展和局限），发表刊物为Cold Spring Harb Perspect Med(NML）.

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将成年体细胞重编程为诱导多能干细胞 (iPSC) 的方法的发现提高了为多种疾病提供真正个性化治疗选择的可能性。与胚胎干细胞 (ESCs) 类似，iPSCs 可以在体内产生任何细胞类型，并且可以通过同源重组进行基因校正。

iPSC 的这些 ESC 特性允许为许多目前无法治愈的疾病（包括遗传性皮肤病）开发永久性矫正疗法，而无需使用胚胎组织或卵母细胞。在这里，我们回顾了 iPSC 研究的最新进展和局限性，重点关注 iPSC 的临床应用以及使用 iPSC 模拟人类疾病以在皮肤病学领域发现药物。

基本上所有最具破坏性的遗传性皮肤病形式，例如大疱性表皮松解症 (EB) 亚型和先天性鱼鳞病都是由已知的单基因缺陷引起的，理论上应该使他们能够在基因水平上进行校正。

在源自患有皮肤病的患者的 iPSCs 中实现的校正可以随后将这些校正的 iPSCs 分化为自体皮肤细胞用于移植。除了遗传性皮肤病之外，iPSC 技术还可能适用于伤口愈合、脱色障碍和美容皮肤病学。

基于 iPSC 的遗传性皮肤病疗法的成功开发取决于四个重要步骤（图 1）。首先，细胞需要从患者的皮肤活检中分离出来。其次，这些细胞必须重新编程为 iPSC。第三，生成的 iPSC 中的遗传缺陷需要通过安全的方法进行纠正，优先通过同源重组 (HR)。第四，这些经过基因校正的患者特异性多能细胞必须分化成与其疾病相关的细胞类型，然后作为自体移植物移植到同一患者身上。未校正的 iPSC 也可用作疾病相关的患者特异性细胞来源，用于体外疾病建模和体内异种移植建模，这将为对疾病机制和药物发现产生新的见解提供平台。

图 1

iPSC 的皮肤病学应用。iPSCs 的产生允许开发干细胞替代策略来治疗遗传性皮肤病和对这些疾病进行建模，目标是为患者提供新的治疗选择。最初，需要从患有遗传性皮肤病的患者的皮肤活检中分离细胞。适合重编程的细胞类型是角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞。在重编程期间，细胞获得 ESC 特性并经历“再生”，这可以通过端粒的延长和线粒体功能的恢复来确定。然后可以通过 HR 对生成的 iPSC 进行基因校正。校正后的 iPSC 克隆可以分化成相关的细胞类型进行移植，并作为自体移植物返回给患者。或者，未校正的 iPSC 可以分化为与感兴趣的疾病相关的细胞类型，用于在器官培养物中模拟疾病或通过移植到免疫缺陷小鼠作为异种移植物在体内重现疾病表型。

重编程遗传性皮肤病患者的细胞

只要 iPSC 可以分化成相关的细胞类型，遗传疾病患者产生的 iPSC 系就可以为研究提供无限的细胞供应和修复基因缺陷的机会。迄今为止，人类 iPSC 已针对多种遗传性皮肤病产生，包括 VII 型胶原蛋白 (Col7) 缺陷型隐性营养不良性大疱性表皮松解症 (RDEB)、LAMB3 基因缺陷型交界性大疱性表皮松解症(JEB), p63 突变外指、外胚层发育不良和唇裂/腭裂 (EEC) 综合征, 表皮松解性角化过度与显性 N188S 角蛋白 1 突变和具有显性 R125C 角蛋白 14 突变的单纯性大疱性表皮松解症 (EBS) 。

此外，iPSCs 已从患有先天性角化不良 (DC) 的患者中获得，这是一种端粒维持疾病，表现为多器官衰竭、癌症和与年龄相关的皮肤表型，如指甲角化不良、伤口愈合延迟和脱发。

还尝试纠正由皮肤病产生的 iPSC 中的缺陷。研究人员使用一种 LAMB3 编码慢病毒被用于纠正源自 JEB-iPSC 的角质形成细胞，COL7A1 基因缺陷型 RDEB-iPSCs 的瞬时基因校正是通过转染编码野生型人类 COL7 基因的表达质粒来实现的。“校正”的 RDEB-iPSC 通过畸胎瘤形成分化成类似于皮肤和造血谱系细胞的结构。同源骨髓间充质细胞先前已被证明可以移植到皮肤中，再生受损的上皮细胞，并在 RDEB 患者和小鼠模型的起泡区域恢复 Col7 的产生。因此，经过校正的 iPSC 可以提供无限的表皮和间充质谱系自体细胞来源，用于治疗 RDEB 和潜在的其他皮肤水疱疾病。

iPSCs 分化为皮肤细胞

将 iPSC 分化为相关细胞类型的能力是成功开发基于 iPSC 的治疗策略的重要先决条件。最近从 iPSC 中获得了角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞。通过依次应用视黄酸和骨形态发生蛋白 4 (BMP4)，小鼠和人类 iPSC 已分化为角质形成细胞。当用小鼠成纤维细胞移植到无胸腺裸鼠上时，小鼠 iPSC 衍生的角质形成细胞显示形成表皮和皮肤附件，而人类 iPSC 衍生的角质形成细胞能够在培养中建立功能性器官皮肤。角质形成细胞也由 RDEB-iPSCs、JEB-iPSCs、EEC-iPSCs和 EBS-iPSCs 产生并显示在体外生长时概括了相应疾病的表型。通过向培养物中补充 Wnt3a、干细胞因子和内皮素-3，黑素细胞可以从 iPSC 中获得，而用 EGF 和 BMP4 处理 iPSC 培养物可以产生成纤维细胞。虽然现在存在将 iPSC 分化为主要皮肤细胞类型的方案，但尚未进行严格的研究来确定这些 iPSC 衍生细胞是否与其正常皮肤等价物相同。

定制基因矫正疗法

目前用于将基因转移到体细胞皮肤细胞中的技术受到许多限制。最大的障碍之一是安全载体的可用性，这些载体能够产生持久的治疗效果，并且插入诱变的风险低。基于质粒和腺病毒载体的基因递送方法在诱导角质形成细胞的长期矫正效果方面效率低下，并且与生物安全问题相关。因此，通过 HR 进行的基因矫正疗法可能是遗传性皮肤病的唯一永久治愈方法，特别是对于那些涉及隐性功能丧失突变的疾病，如 JEB 和 RDEB 中发生的那样。因为驻留在增殖性基底层中的成体干细胞不断更新表皮，所以任何永久性遗传校正都必须针对该干细胞群。然而，迄今为止，还没有人报道成功使用 HR 技术来纠正人类角质形成细胞干细胞中的缺陷基因。Mavilio 等人进行了唯一成功的对水疱疾病进行永久性基因校正的临床试验，在这种情况下是 JEB，并使用逆转录病毒载体恢复层粘连蛋白 322 的表达。由于使用逆转录病毒载体的安全问题，该试验被搁置。

有几种方法可以诱导 HR，这些方法可以与 iPSC 的产生相结合，以实现遗传性皮肤病的基因修复。可以使用由核酸酶结构域和单独的、定制的 DNA 识别结构域组成的嵌合分子来实现 iPSC 中的增强 HR。这些嵌合分子可以在特定的 DNA 序列中引入双链断裂 (DSB)。携带正确基因序列和与 DSB 侧翼序列同源性的外源供体 DNA 的存在触发 HR 并用校正的基因替换有缺陷的基因。

锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应核酸酶 (TALENs)是能够将特定 DSB 引入基因组 DNA 并广泛用作研究和基因治疗工具的嵌合核酸内切酶的主要代表。除了 ZFN 和 TALEN 之外，最近还采用了一种基于核酸酶的新型技术来实现人类 iPSC 中的基因组编辑。

该技术使用 II 型原核 CRISPR（成簇的规则间隔的短回文重复序列）/CRISPR 相关 (Cas) 系统，当由短 RNA 指导时，可以高效地在内源基因组位点诱导精确切割。基于 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 的基因修饰策略已成功用于人和小鼠 ESC 和 iPSC。此外，奥斯本等人最近的一项研究，示了在个性化基因组编辑策略中使用嵌合核酸内切酶治疗遗传性皮肤病的潜力。使用 TALEN，研究人员对从 RDEB 患者分离的原代成纤维细胞中的 COL7A1 基因突变进行了特定的杂合校正。然后使用这些校正的成纤维细胞生成适合分化为校正的自体角质形成细胞的 iPSC。Osborn 等人的原理验证研究，提供了一组重要的数据，这些数据值得进一步研究基于核酸酶的基因组编辑方法在遗传性皮肤病矫正中的适用性。

细胞重编程组织再生的潜力

iPSC 的产生与基因靶向相结合可以解决与体细胞基因校正相关的许多障碍。与体细胞不同，iPSC 可以无限扩增，从而更容易选择和扩增校正的克隆。此外，重编程过程导致完全有能力的细胞“恢复活力”，如衰老途径的下调、端粒的延长和线粒体功能的恢复所示。报告表明 iPSCs 可以来自非常年老的患者，并且这些 iPSCs 可以分化为在端粒长度和线粒体功能方面表现出“再生”表型的成纤维细胞。重编程还恢复了源自常染色体显性 DC 患者的细胞中的端粒长度，这是由端粒酶 TERT 的催化蛋白成分的杂合突变引起的，有望为这些患者带来新的治疗益处。

因此，重编程可能是组织再生的关键，并提供对衰老和长寿机制的见解。虽然现在很清楚来自老年患者的细胞可以重新编程，但仍需要更多的研究来更好地了解年龄如何影响 iPSC 质量，以及重新编程的“恢复活力”特性如何用于逆转皮肤老化和改善干细胞的结果——皮肤病的基础疗法。作为一个特定的例子，从患有遗传性皮肤病的患者中产生 iPSC 可能会提供“再生”的成人皮肤干细胞的来源，这些干细胞很可能由于修复起泡组织的失败尝试而耗尽。在使用基因校正的角质形成细胞干细胞治疗 JEB 患者的报道中，角质形成细胞干细胞的耗竭尤为明显。此外，重编程的“恢复活力”特性可能适用于治疗老年人的慢性伤口，为移植提供自体的、类似年轻的皮肤细胞。

回复马赛克作为自然基因疗法

尽管 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系统可以显着提高 iPSC 中基因校正的效率，但需要进行广泛的基因分析，以消除如果 iPSC 使用这些方法进行基因校正时可能发生的脱靶事件的担忧。自然发生的体细胞逆转可能提供适合移植的基因校正细胞的替代来源。

在许多人类遗传疾病中观察到遗传突变的“自然”体细胞逆转，例如范可尼贫血、Bloom 综合征、Wiskott-Aldrich 综合征，如以及遗传性皮肤病。有许多关于遗传性皮肤病患者的回复性嵌合体的报道，包括 RDEB、JEB 、EBS  和五彩纸屑鱼鳞病。回复性嵌合体表现为遗传性皮肤病患者的正常皮肤斑块。这些斑块代表具有获得性继发性突变的细胞的克隆生长，这些突变抵消了原发性突变的影响并逆转了疾病的表型。几种机制负责回复细胞中的第二次“纠正”基因事件，包括基因转换、第二位点突变、基因内交叉等。因此，在 RDEB 或 JEB 等疾病中从自发回复的皮肤细胞生成 iPSC 可为细胞替代疗法提供无限量的自然校正细胞。

用于疾病建模的 iPSC

尽管皮肤细胞可以很容易地从患者的活组织检查中分离、扩增并用于在器官培养中模拟遗传性皮肤病，但它们的短寿命限制了它们在体外研究中的适用性。体细胞系的永生化依赖于癌基因的组成型表达，这可能会极大地影响感兴趣的细胞类型的表型。

iPSC 技术提供了可再生的患者特异性细胞来源，这些细胞随后分化为相关细胞类型，可用于生成患者特异性器官或体内异种移植模型。源自疾病特异性 iPSCs 的皮肤细胞在 3D 培养物中保持其表型，如 RDEB-iPSCs 分化为角质形成细胞所示，并且对于皮肤生物学和遗传皮肤的许多方面的研究可能是无价的疾病。基因操纵 iPSC 的能力也将允许通过相关基因的靶向诱变而不使用 ESC 来模拟皮肤病。这对于建模罕见的遗传性皮肤病（如 RDEB、EBS 和 JEB）可能特别重要。全球这些疾病的低发病率限制了研究数据的积累，并阻碍了为这些皮肤病制定治疗策略的进展。

由于易于接触，皮肤是测试再生医学新概念的有吸引力的器官，基于 iPSC 治疗遗传性皮肤病的治疗策略就是一个很好的例子。iPSC 在生成平台以更好地了解疾病机制、药物筛选以及最终基于 iPSC 的治疗方法方面的潜力是巨大的，并为真正的个性化医疗提供了可能性。iPSCs 不仅可以消除从受精的人类胚胎中产生 ESCs 的需要，而且还可以避免同种异体细胞移植过程中不可避免的免疫反应的并发症。尽管仍处于年轻阶段，但 iPSC 领域正在获得发展势头，它有望改变我们治疗遗传性皮肤病患者的方式，并逆转影响皮肤的与年龄相关的疾病。毫不奇怪，2012 年诺贝尔生理学或医学奖被约翰·格登爵士（Sir John Gurdon）共同授予，因为他开创性地发现青蛙卵母细胞的细胞质中含有可以重新编程成年体细胞核以产生存活青蛙的因子，而山中伸也（Shinya Yamanaka）的发现这些重编程因子的真实身份，为使用基于 iPSC 的技术治疗包括皮肤病在内的多种人类疾病打开了大门。