脐带间充质干细胞移植并康复治疗脑出血后遗症1年随访

近年来大量的动物实验显示，干细胞移植可以有效修复受损的脑细胞，改善神经功能治疗脑出血，很多学者将神经干细胞直接注入缺血性鼠脑中，发现部分神经干细胞可以在脑中成活，并向受损部位迁移，有限的增殖分化为损伤缺失的神经细胞。

2003年Jeong等用胶原酶注入大鼠脑内制作脑出血模型，将人胚胎源性神经干细胞静脉注入模型，神经干细胞可迁移到血肿周围区，分化成神经元(10%)、星型胶质细胞（75%），促进了脑出血后神经功能的恢复。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源广泛，存在于多种组织中，其中尤以脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymal stem cells, UCMSCs)更为原始，分化能力更强，且其来源于胚胎组织免疫原性更低。

大量研究表明UCMSCs具有多向分化潜能，它在体外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞及神经元细胞等。

因此其在组织工程、造血干细胞移植以及基因治疗等领域具有广阔的应用前景，成为干细胞研究的热点。

由于人UCMSCs易取材、易移植、易培养等优点，与神经干细胞相比，更适合应用于临床。作者在干细胞移植不断被报道应用于临床治疗脑血管疾病的基础上，应用人UCMSCs移植联合综合康复治疗脑出血后遗症。

1、对象和方法

设计：非随机同期对比观察试验。

时间及地点：病例来自于2008-05/2009-12解放军第251医院神经外科。

对象：选择解放军第251医院神经外科收治的脑出血患者45例，男32例，女13例；年龄32~65岁，平均48.6岁。按照入院单双日分为2组，治疗组22例，对照组23例。

诊断标准：脑出血的诊断符合1995年全国第4次脑血管病学术会议通过的诊断标准，并经过颅脑CT和MRI检查证实。

纳入标准：①经颅脑CT和MRI检查证实的脑出血患者。②生命体征稳定者。③本次治疗前未接受过系统的康复治疗者。④对治疗方案知情同意者。

排除标准：①严重精神障碍者。②患严重心、肺、肝、肾等脏器功能不全和严重高血压者。③合并有其他疾病所致的肢体功能障碍者。

技术路线：

常规治疗方法：所用患者均接受常规脱水降颅压、营养脑组织、预防肺部感染等药物治疗，需要手术治疗者包括单纯微创碎吸或者开颅清除血肿治疗，经过治疗后症状逐渐趋于稳定。

在此基础上，治疗组患者接受干细胞移植及康复治疗，对照组患者单纯接受康复治疗。

UCMSCs的分离、培养：健康胎儿脐带标本来源于解放军第251医院。经产妇知情同意，经全面检查产妇身体健康，采集足月正常分娩或剖宫产健康胎儿脐带，1~24h内处理样本。

将脐带除去血管，切成小块，并将种植块转移到加有DMEM完全培养基的培养皿中，置于37℃、体积分数5%的CO₂饱和湿度培养箱内培养，5~7d后首次换液，此时细胞已贴壁生长，以后每两三天用DMEM完全培养基换液，达到70%~80%融合时，用2.5g/L胰酶常规消化传代，根据细胞数量按1:2~1:3比例传代，继续扩增培养。

干细胞表型鉴定：用流式细胞仪对第3代UCMSCs表面特异性抗原进行检测。2.5g/L胰蛋白酶消化待检细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10⁹L^-1，分别加入CD34-FITC，CD45-FITC，CD29-FITC，CD44-FITC抗体10µL进行标记，室温孵育15min后弃上清，以PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测分析。

UCMSCs移植：人UCMSCs由解放军第251医院中心试验科提供，一般为取第3代UCMSCs，2.5g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2.0×10⁷L^-1时供移植应用。

常规移植前检查无明显手术禁忌证后，按照全脑血管造影的流程进行，寻找到脑组织出血损伤区域的主要供血动脉，一般常见的是大脑中动脉区域，确定后注入内含1.5mL 2.0×10⁷L^-1UCMSCs及盐酸地塞米松0.03mg总量为5mL的生理盐水，移植后加压包扎术口24h，观察下肢血运情况。

综合康复治疗：治疗组在干细胞移植后，两组同时开始积极康复治疗，包括运动疗法、针刺疗法及作业疗法和高压氧治疗，所有康复治疗相配合治疗共计60次。

①运动疗法：根据受损神经所支配肌肉的肌力而采用不同的训练方法与运动量，1次/d，30~45min/次。

②针刺疗法：头针主要为运动区，用电针刺激；体穴位于百会、四神聪(经外奇穴)，用补法及电针交替治疗；人中、攒竹、肩三针、曲池、少海、外关、足三里、三阴交、血海、环跳、阳陵泉，仰卧与俯卧交替取穴；辨证取穴：瘀血阻滞型加十二井穴、颈夹脊；气血虚弱型加关元、中脘、脾俞；肝肾不足加肾俞、腰阳关、腰眼。

按照常规操作进针后，加接G6805-Ⅱ型电针治疗仪上，选用连续波，频率30次/min，强度以患者耐受为度。以上每次留针30min，1次/d，治疗12d为1个疗程，每个疗程间休息两三天。

③作业疗法：从日常生活、手工操作劳动中，选出一些针对性强，能恢复患者减弱的功能和技巧的作业，比如吃饭、穿衣等，针对患者所存在的问题，进行功能性作业治疗，让患者按照指令的要求训练。1次/d，45min/次。

④高压氧治疗：采用多人或单人氧舱，压力为0.2MPa，加压及减压均20min，稳压吸氧60min(每吸20min休息5min，吸舱内空气)，1次/d。

指标检测：治疗组所有患者移植后48h行心电监护。所有病例在开始接受治疗后6、12个月末分别检测血常规、血生化指标、肿瘤酶标物，检查颅脑MRI，监测间充质干细胞移植的安全性。随访1年，以死亡作为研究终点。

患者治疗前后均按照Fugl-Meyer评测法(Fugl-Meyer Assessment，FMA)评定患者的肢体功能运动，采用改良Barthel指数(modified Barthel index，MBI)评定患者的日常生活活动能力。

FMA法总分100分，

不良反应观察：观察患者有无异常症状、体征，凝血功能。

主要观察指标：①肢体运动功能程度和日常生活活动能力。②干细胞移植的安全性。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 12.0软件完成统计学处理，资料以`x± s表示，组间比较应用t检验，P

2、结果

2.1 参与者数量分析  纳入脑出血患者45例，其中治疗组22例，对照组23例。采用意向性分析，全部进入结果分析，无脱落。

2.2 人UCMSCs细胞免疫表型分析结果 经过流式细胞仪检测显示，人UCMSCs附壁细胞强，表达CD44和CD29，不表达造血细胞表型CD34和CD45，初步说明从脐带分离出的附壁细胞为UCMSCs。

2.3 两组基线资料比较  治疗组中，出血部位位于基底核区12例，血肿量平均50.8mL；丘脑6例，血肿量平均32.5mL；脑叶4例，血肿量平均42.6mL；病程10~18d，平均14d。后遗症主要症状为偏瘫18例，单瘫4例，失语5例。

对照组中，出血部位位于基底核区13例，血肿量平均49.5mL；丘脑7例，血肿量平均30.2mL；脑叶3例，血肿量平均44.1mL；病程11~17d，平均15d。后遗症主要症状为偏瘫20例，单瘫3例，失语6例。

两组在年龄、性别、发病因素、出血部位、血肿量等方面差异无显著性意义(P>0.05)

治疗组开始治疗前障碍程度Ⅰ~Ⅱ级，移植后1个月末障碍程度Ⅰ~Ⅱ级，3个月末障碍程度Ⅱ~Ⅲ级，6个月末障碍程度Ⅱ~Ⅳ级，12个月末障碍程度Ⅱ~Ⅳ级。

移植后1个月较移植前差异有显著性意义(PP

但是治疗后1，3，6及12个月同期相比，治疗组Fugl-Meyer评分显著高于对照组(P

2.5 两组日常生活活动能力比较（见表2）   治疗组移植后1个月改良Barthel指数显著高于移植前(PP

但是治疗后1，3，6，12个月同期相比治疗组改良Barthel指数显著高于对照组(P

2.6 两组颅脑MRI检查结果比较   两组治疗后6，12个月分别检查颅脑MRI与治疗前比较脑部病灶范围均缩小，但是治疗组治疗前后及同期治疗后与对照组比较病灶范围缩小的程度更为明显，差异有显著性意义(P

脑部病灶范围表示方法应用类似于脑内血肿量计算方法即多田公式计算，见表3。

2.7 不良反应及安全性评价  所有患者均完成治疗过程，并获得12个月的随访。移植后24h内有2例感胸闷及发热，观察48h后自然恢复。

所有患者康复治疗后6、12个月分别检查各项生化指标基本正常，无特殊异常反应。

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3、讨论

3.1 相关知识点  长期以来，成年个体中枢神经系统甚至被认为无再生能力，目前主要依靠高压氧和功能康复治疗外，仍缺乏更为有效的办法。

近年来，干细胞移植治疗神经系统疾病给脑出血患者带来希望，成为临床控制脑出血后遗症状成为可能，神经系统疾病细胞替代治疗最理想的种子细胞是神经干细胞，但是神经干细胞取材困难，限制其临床应用。

骨髓间充质干细胞和神经干细胞移植治疗脑出血的研究已有报道。用于细胞移植和基因治疗的供体细胞研究较多，脐带来源的MSCs是继胚胎干细胞和神经干细胞之后，又一种在体内外均能向神经细胞分化的干细胞。

研究证实，UCMSCs存在于脐带沃顿胶(Wharton’s jelly)和血管周围组织中，UCMSCs体外培养符合干细胞特性，在不同诱导条件下UCMSCs可分化为脂肪细胞、骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰岛细胞、神经细胞等。

UCMSCs与骨髓来源的MSCs在细胞形态、免疫表型、生物学特性及功能特点等方面都极为类似，并具有其独特的优势。脐带富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/组细胞，于骨髓来源的MSCs相比较，人脐带来源MSCs的优势在于收集过程相对简单、无创、胎盘屏障使脐带受病毒与细菌污染少、脐血免疫系统的原始性降低了移植后受体发生排斥反应的概率。

并具有分化能力强，具有胚胎细胞的特性，不受年龄的限制等特点。迄今研究表明，脐带来源的MSCs不但能够成为骨髓MSCs的理想替代物，因其表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

脐带来源的MSCs提供了新的干细胞来源，且具有明显的优越性：脐带来源广泛，分离MSCs可将脐带变废为宝；脐带MSCs病毒感染机会小，对供者无不良影响，克服了骨髓源MSCs随供者年龄增长而增殖能力下降缺点，使脐带MSCs可能替代骨髓MSCs，成为MSCs的主要来源之一。

UCMSCs呈成纤维细胞形态，在体外培养体系中能快速增值，传代后3~5d能增值四五倍，传代培养10代以上细胞可增加5~10倍，且增值速度无明显降低，传代稳定。

体外分离、培养及扩增的UCMSCs为临床干细胞移植治疗多种神经系统疑难病症创造条件，并由大量的实验室研究获得良效，逐渐转向临床治疗。

作者在此基础上，应用人UCMSCs介入途径移植治疗脑出血后遗症，并配合综合康复治疗，治疗所有病例中，全部完成治疗过程，移植前后比较FMA评分及MBI评分，FMA评分治疗前为(31.28±20.62)分，障碍程度Ⅰ~Ⅱ级。

治疗后12个月为(82.59±16.38)分，障碍程度Ⅱ~Ⅳ级；移植前后差异有显著性意义(P

MBI评分治疗前为(18.89±12.05)分，治疗后12个月为(70.35±11.29)分，移植前后差异有显著性意义(P

两项指标表明，移植后3个月后功能改善更为明显，初步表明，干细胞移植配合综合康复治疗脑出血后遗症有效，配合综合康复治疗协同解决其起效慢的缺点，但干细胞移植后起效持续时间长，3个月及6个月后明显，12个月后仍有效，大部分病例不能在短时期达到明显的疗效，在临床中应用提醒的是，对于接受治疗的患者及其家属应该有充分的思想准备，对于要求短时间内达到一定疗效的情况，应该谨慎应用。

本组治疗后颅脑MRI检查显示病灶明显缩小，脑组织受损面积无进一步扩大，一定程度上说明干细胞移植有利于抑制脑组织凋亡及为组织再生创造的良好环境等的作用。所有接受治疗的患者中，通过进一步随访并检查未发现明显的不良反应，为下一步继续应用于临床治疗中枢神经系统疾病提供一定的依据。当然病例数量少，不能完全说明问题，需要以后逐渐的临床应用中不断探讨及摸索。

通过以上数据初步表明，临床应用UCMSCs移植治疗脑出血后遗症是安全的、可行的、有效的，考虑其原因为：

①具有标准化的制备MSCs流程，提前制备出具有生物学特性的MSCs，能够在合适时机及时应用。

②MSCs传代次数较少，尽量减少细胞在体外环境暴露的时间，有效的保留其较强的免疫调节功能。

③具有合理的运输半径，MSCs制备成功到临床应用控制在半小时以内，保证其时效性。

④治疗时间避开了脑组织损伤/炎症急性期，更有利于MSCs发挥其抑制“免疫监控”及创造一个有利于受损组织修复再生的微环境的作用。

⑤同时注重移植途径，介入治疗可能较静脉输注更有利于增加MSCs迁移到脑组织受损部位的浓度，增加疗效。

⑥合理进行综合康复治疗。因此，作为治疗脑出血后遗症的新方法，人UCMSCs疗法是非常有潜力的。

干细胞疗法从实验室走向临床需要建立一个新的、完全与化学药品不同的、可能更为复杂的临床转换体系。首先不同来源的MSCs会产生不同形态的MSCs，存在不同的疾病应用何种来源的MSCs疗效会更好的问题；

其次细胞的分离培养、传代次数、细胞的运输方法、治疗时机及给细胞途径等因素可能会影响MSCs的活性从而影响其临床疗效，存在如何尽量减少影响MSCs活性的变量因素的问题。有待于下一步在不断的临床实践中摸索和探讨。

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3.1 文章的偏倚或不足  文章中观察病例数量少，只能从某一种角度分析问题，观察结果存在一定的人为因素，观察疗效的因素存在多种因素，实验设立的对照组仅限于未行干细胞移植的脑出血患者，缺乏与静脉注射、蛛网膜下腔注射等多途径治疗方式的对照。此外随访时间短，缺乏对干细胞移植长期有效性和安全性的观察，需要不断进行多途径移植、在大样本分析研究中得到进一步的验证。

3.2提供临床借鉴的意义  脐带干细胞移植在临床治疗中有其特殊的优势，具有收集过程相对简单、无创、污染性低，分化能力强、具有胚胎细胞特性、不受年龄限制等特点。同时不受治疗时间的限制，能够做到及时配型及时应用，为治疗提供方便。

治疗时间尽量选择在脑水肿恢复期，极大增加了干细胞的活性，同时配合积极有效的康复治疗，可获得良效，为改善脑出血患者的预后、提高生活质量提供了一个有效途径。