Cells | 再生医学的未来：使用多能干细胞的细胞疗法和基于细胞外囊泡的无细胞疗法

2021年10月28日Cell期刊发表了一篇题为The Future of Regenerative Medicine: Cell Therapy Using Pluripotent Stem Cells and Acellular Therapies Based on Extracellular Vesicles的文章，全面综述了再生医学的未来：使用多能干细胞的细胞疗法和基于细胞外囊泡的无细胞疗法。文章主要内容翻译如下：

文章提到，干细胞研究领域的快速进展为其在受伤或患病组织的再生药物应用中使用了强大的基础。增长证据表明，一些观察到的干细胞疗法的治疗结果是由于旁分泌作用而不是移植细胞的长期植入和存活。鉴于它们对生物屏障和介导生物活性分子的细胞间信息转移的能力，细胞外囊泡被探索为潜在的无细胞治疗剂。

在许多疾病的背景下，特定细胞类型的退化和/或功能障碍会影响组织和器官，这会随着时间的推移而恶化并失去其功能。在这种情况下，再生医学为否则仍未治疗的病理学提供了新的视角。

细胞来源

已经考虑了各种细胞来源用于细胞疗法和再生药物，包括来自活体供体或尸体，胎儿材料和多能干细胞系的成人材料。

来自成人来源的细胞材料可以直接从患者获得，并在体外纯化/扩增（如间充质干细胞（MSC）或来自皮肤上皮细胞）。这种自体方法可防止拒绝的风险。然而，基于自体细胞的治疗产品的制造过程和供应物流非常复杂并且阻碍了它们的发展。当涉及年龄相关黄斑（AMD）或治疗所需的细胞数量很重要时，这些限制是尤为重要的。

用于细胞疗法的另一个材料来源是胎儿。收获细胞保留了优于成人细胞的增殖潜力。尽管胎儿茎/祖细胞受到限制的潜力，但产生有限的细胞类型，但其中一些细胞不再存在于成人组织中，因此可以用于产生特异性细胞类型。尽管如此，他们的访问是世界各地的高度变化，具体取决于每个国家的堕胎法和政策。事实上，在一些国家，严格禁止。

人诱导多能干细胞（HiPSC）被认为是再生医学的有前途的细胞来源。HiPSC是自我可再生的，产生任何人体的细胞类型。HiPSC可以与良好的培养工艺（GMP）设施和质量控制实现大规模工业生产，这与任何其他更传统的药品一样。

基于 hPSC 的细胞疗法：精选示例

视网膜变性

视力障碍的不同原因，例如 AMD、色素性视网膜炎 (RP) 和糖尿病性视网膜病变，其特征是眼睛的光敏部分：视网膜退化。根据疾病的性质和/或阶段，不同的细胞类型容易退化。特别是，视网膜色素上皮 (RPE)，一种在 AMD 和某些形式的 RP 中受影响的视网膜的重要支持组织，会引发光感受器 (PR) 的退化。因此，为了防止 PR 退化和随后的视力丧失，出现了一个特定的焦点来替换死亡或功能失调的 RPE 细胞。

在过去的十年中，已经开发了几种基于自发分化的方法来将 HiPSC 转化为 RPE 细胞。分化是由 FGF2 退出（用于维持 HiPSC 的多能性状态）启动的。几周后，在培养的细胞中开始出现色素簇。这些簇对应于 RPE 细胞，可以手动分离然后扩展。在该过程结束时，hPSC-RPE 细胞储存在冷冻管中，可以按需解冻。

这些  HiPSC-RPE 细胞的治疗潜力在作为细胞悬浮液注射到内源性 PR 和 RP 大鼠模型的 RPE/布鲁赫膜之间的视网膜下空间后进行了评估。所有这些研究都证明了 hPSC-RPE 细胞具有保护 PRs 和恢复视觉功能的好处。最近通过在不同支架上重建有组织的 RPE 上皮对最终配方进行优化，提高了移植物的存活率和治疗效果。这种作为有组织的组织的配方需要开发特定的装置来制备治疗产品并将其输送到眼睛。

皮肤伤口愈合与修复

皮肤伤口主要由创伤或热烧伤引起，可以由身体自修复。自伤愈合的不同阶段包括：（1）止血，以阻止血液损失，并为细胞迁移提供支架，（2）炎症，以消除病原体和组织碎片，特别是角质形成细胞的增殖，以实现伤口覆盖（4）通过皮肤成纤维细胞分泌的胶原蛋白的重塑。然而，愈合过程可以通过伤口的大小，环境因素（压力，吸烟，药物或娱乐药物）或影响皮肤或伤口愈合能力的遗传障碍的愈合过程损害。

闭塞式敷料可以应用于伤口，以通过提供机械保护和潮湿和清洁的环境来改善愈合，这些环境有利于重新上皮化。当这是不够的时，由表皮祖细胞的体外膨胀可以获得不同的外部生物或自体细胞的皮肤替代物。

这些皮肤替代物可以由表皮，皮肤或Dermo-Ebidermal（复合）层组成。例如，来自供体的自体角质形成细胞的片材在体外膨胀以产生大表皮片。然而，这种方法是耗时的，并且在严重的烧伤的情况下，为生成角质形成细胞的现成银行的策略将改善患者护理。这种目标是通过制备来自HPSCS的皮肤替代品来实现，这促进了适用于大规模使用和临床相容的工业生产的大型细胞库的生产。

HPSC已经成功地分化为基础角蛋白细胞，能够在啮齿动物体外和体内形成多个异丙表皮。然而，根据疾病背景，应控制炎症，应促进血管生成以保持移植物。因此，需要复杂的组织工程来改善移植物整合和生存。内皮细胞，成纤维细胞和胶原蛋白可以是重建皮肤的一部分，以模仿皮肤层并有利于血运重建。

使用多种细胞类型的固有难度是它们正确的空间组织来重建复杂的皮肤结构，以确保移植物的功能整合。有希望的结果是使用皮肤替代物中的具有IPSC衍生的内皮细胞的微观图案化的3D血管网络获得，具有更好的植入和长期存活以及在免疫缺陷小鼠中接枝时的改善的功能。实际上，皮肤衍生的细胞外基质生物导芯减少了使用胶原蛋白观察到的收缩和收缩。此外，它有利于上皮组织和障碍功能。

心脏梗塞治疗

尽管介入和药物治疗疗法进展，但心力衰竭是全世界人死亡的第一个原因。与低脊椎动物相比，人心肌或心肌几乎没有再生潜力，丢失的组织被纤维化疤痕所取代。现有的治疗不是治愈性的，并且不会引发心脏再生。细胞疗法可以通过将相同的收缩性能的移植与心肌细胞分享相同的收缩性质来解决这种瓶颈。

已经开发了各种方案以从3D或2D培养物中产生来自HPSC（HPSC-CMS）的心肌细胞，其中一些具有高产率和使用生物反应器的纯度。例如，HPSC通过暴露于BMP-2致力于心脏中胚层谱系。然后通过抑制SU-5402的成纤维细胞生长因子受体将心血管祖细胞保持在祖细胞中。或者，WNT信号通路的时间调节（即，初始激活，然后抑制）足以触发HPSC-CM分化。HPSC-CMS显示心肌细胞的一些主要特征，如收缩性，离子通道，钙处理和激发繁殖。

已经在啮齿动物和较大的动物（猪或灵长脂）中进行了HPSC-CM功能的临床前评价。通过肌内途径或组织工程之后将细胞作为细胞悬浮液递送。在将同种异体PSC-CMS或HESC-CMS注射后，作为心肌梗死的灵长类动物的细胞悬浮液，心脏收缩功能改善了。此外，证明PSC-CMS的注射优于骨骼肌细胞或MSCs，用于恢复缺血性损伤的猪模型中的心脏功能和氧气消耗。

使用细胞外囊泡（ EV）的临床试验

近年来，越来越多的研究表明，细胞外囊泡（外泌体）作为活性剂或递送系统可能具有显着的治疗潜力。EV 主要被开发为用于抗肿瘤/免疫调节疗法、药物输送和再生疗法的工具 。此外，EV 在探测宿主的病理生理状态方面被广泛研究，作为生物体液中潜在的生物标志物，用于诊断和监测各种疾病。

近年来，正在进行、计划中或已完成的临床试验越来越多。为了评估 EV 在转化临床试验中的使用，我们在 ClinicalTrials.gov 网站上搜索了关键词“外泌体”、“细胞外囊泡”或“微囊泡”。结果显示了与疾病背景和 EV 来源相关的每个 EV 亚群。

到目前为止，大多数研究都调查了 EV 作为生物体液（如血液和尿液）中可靠生物标志物的用途，用于诊断和预后。来自树突状细胞和肿瘤细胞的 EV 的免疫调节特性也正在探索作为无细胞抗肿瘤剂。已在 I 期和 II 期临床研究中获得了有希望的结果。一项 II 期临床试验 (NCT01159288) 评估了载有主要组织相容性复合体 (MHC) I 类和 II 类限制性癌抗原的树突状细胞 (DC) 衍生的 EV 作为诱导化疗后无法手术非手术患者的维持免疫疗法的治疗潜力。-小细胞肺癌 (NSCLC) 。这项 II 期试验表明，DC 衍生的 EV 在晚期 NSCLC 患者中发挥 NK 细胞效应功能，增强了抗肿瘤免疫的 NK 臂。

最近的注意力集中在 EV 作为脱细胞再生医学的治疗工具的潜在兴趣上。30 项介入性临床试验基于 EV 用于治疗目的。其中只有 16 个专门评估干细胞衍生的 EV 在患者中的治疗效果和安全性。

越来越多的证据表明，EV 可以在许多应用中重现其亲代细胞的有益作用。为了与我们之前的部分进行比较，我们将在此重点介绍使用 EV 作为影响眼睛、皮肤、心脏和骨骼肌的疾病的治疗工具获得的最新进展。我们还探索了如何整合基于细胞的疗法和无细胞疗法，以利用这两种方法的优势并增强治疗效果。

眼睛修复问题

已经评估了 EV 对 RP、AMD 和眼部损伤后的治疗效果。大多数这些研究都集中在 EV 限制炎症的潜力上，否则炎症会引发视网膜细胞的死亡 。如前所述，不同的研究已经开始表明，产生有益效果可能不需要细胞的存在。例如，人类神经祖细胞的视网膜下植入通过旁分泌效应保留了 RP 模型的视力。

在模拟 RP 和人类患者的大鼠中，人胎视网膜祖细胞也引起了相同的效果。由于这些移植是在 PR 变性之前进行的，因此显然不希望替换死细胞。在此基础上，在视力丧失之前，将源自神经祖细胞的 EV 注射到造模 RP 的大鼠的视网膜下。单次注射后，视觉功能和 PR 存活率得到暂时改善（最多 28 天后手术）。EVs 主要由从内部视网膜迁移到视网膜下空间的 Iba1+ 小胶质细胞内化。EV 诱导促炎细胞因子的下调并抑制小胶质细胞，其抑制激活与 RP 中的 PR 存活有关。

皮肤伤口愈合

由大面积烧伤、感染或外伤引起的严重皮肤损伤需要医疗干预才能正常愈合。治疗策略旨在促进皮肤伤口愈合的 4 个阶段——稳态、炎症、增殖、重塑——以加速伤口修复和再生。这些阶段的分子和细胞事件紧密协调，许多细胞类型以高度协调的顺序相互作用以恢复受损组织。

EVs 具有促进伤口愈合各个阶段和促进皮肤再生的潜力。从炎症阶段过渡到增殖阶段是成功伤口愈合的关键步骤。在炎症的早期阶段，绝大多数巨噬细胞向促炎 (M1) 表型分化。

随着伤口成熟，该比率转变为促进组织重塑和伤口愈合的 M2 表型。从脂多糖预处理的 MSC 中获得的 EV 可以将 M1 巨噬细胞极化转化为 M2 表型，从而减轻炎症，并通过穿梭 let-7b miRNA 促进大鼠糖尿病皮肤伤口愈合。同样，MSC 衍生的 EV 通过 miR-223 调节巨噬细胞极化，促进小鼠皮肤伤口愈合。与这些结果一致，hUCMSCs 显着降低了炎症细胞的数量和促炎细胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6 的水平，同时增加了重度烧伤大鼠伤口中抗炎细胞因子 IL-10 的产生。同一团队后来发现，hUCMSC 衍生的 EV 中的 miR-181c 表达通过下调 TLR4 信号通路减少了烧伤诱导的过度炎症。

心脏疾病

EVs 已被研究为各种心脏病（如缺血性心脏病和心肌梗塞）的有希望的治疗选择。主要目标之一是促进血管修复机制，以减少会导致细胞死亡的心肌损伤，从而改善心脏功能。

hESC 衍生的 MSC 条件培养基 (hESC-MSC-CoM)，用临床兼容的过程收集，显示含有易调节心血管相关途径的因素。hESC-MSC-CoM 的管理概括了在心肌梗塞后的情况下注射 hESC-MSC 的益处。实际上，在心肌梗塞的猪模型中，hESC-MSC-CoM 静脉内治疗 7 天可增强毛细血管密度，减少心肌梗塞面积并保留收缩和舒张功能。此外，在另一种猪缺血再灌注损伤模型中，hESC-MSC-CoM 减少了心肌细胞凋亡和氧化应激。该 hESC-MSC-CoM 含有 50-100 nm 的大颗粒，这些颗粒经过纯化并表征为 EV。在心肌缺血和再灌注损伤的离体小鼠模型中，hESC-MSC 衍生的 EV 同样减少了梗死面积。

骨骼肌

严重的肌肉损伤和肌营养不良症等遗传缺陷会导致肌纤维死亡。再生骨骼肌纤维的自发修复确实发生，但还不够。治疗方法的一个中心目标是通过重新填充卫星细胞生态位、促进血管化同时抑制纤维化形成和刺激收缩性肌纤维的形成来重建肌肉结构的完整性和功能性。已经提出了几种具有肌源性或非肌源性来源的细胞候选物用于骨骼肌再生，并且它们的移植已成为广泛研究的治疗策略。然而，在通过注射递送细胞后观察到的大量供体细胞死亡和细胞分散限制了它们的治疗潜力。细胞治疗产品距离重建肌肉结构还有很长的路要走，更不用说用神经和足够的血管重建它了。总体而言，可以考虑针对小肌肉进行细胞疗法，但对于影响全身肌肉的疾病难以实施。

越来越多的证据表明，EV 由骨骼肌细胞积极产生，并有助于肌肉修复和再生。例如，在人类骨骼肌成肌细胞 (HSkM) 分化为肌管期间分泌的 EV 含有特定的生化线索，可促进和调节人类脂肪干细胞 (HASC) 的肌源性分化。

与对照组相比，用这些分化的 HSkM 衍生的 EV 治疗撕裂的肌肉部位导致肌肉再生得到改善，大量再生肌纤维与最小纤维化相关。除了促进肌纤维修复外，EV 还可以减弱过度的 ECM 沉积，以实现最佳的肌肉重塑。

在肌营养不良症和严重的肌肉损伤中，纤维化细胞过度活化和过度增殖，导致骨骼肌被无功能的纤维化组织取代。这种细胞外基质成分的过度积累不仅会改变肌肉功能，还会减少可用于治疗和修复的组织数量。建立新的抗纤维化治疗策略是改善患者肌肉功能的主要临床选择之一。

为响应肥大刺激，卫星细胞产生能够分泌含有 miR-206 的 EVs 的生肌祖细胞 (MPCs)，其通过邻近成纤维细胞的核糖体结合蛋白 1 (Rrbp1) 抑制细胞胶原蛋白的表达，从而防止过度的 ECM 沉积。类似地，来自 DMD 患者肌肉活检组织的成纤维细胞分泌的外泌体的 miR199a-5p 水平升高，导致骨骼肌和周围基质中的纤维化增加。这些数据表明 EV 作为潜在的抗纤维化剂可能会引起人们的兴趣。

正如所讨论的，细胞疗法观察到的一些好处可能是由于旁分泌作用可以由这些细胞衍生的 EV 重现，而不是移植细胞的长期植入和存活。总体而言，EV 和移植细胞可以根据目标器官引起不同的结果。在某些情况下，治疗效果可能相似，因此，EV 治疗可能具有最高的效益/风险比。在其他情况下，两种疗法是互补的，两者结合可能会达到最佳治疗效果。