间充质干细胞外泌体在调控组织再生中的重要作用和机制

前言：2019年1月10日，国家药监局发出通知，EGF属于化妆品领域非法添加原料。原因是国家药监局说明了寡肽-1与人寡肽-1（表皮生长因子，EGF）的区别，以及EGF在医学临床上的应用范围和效果。一句话，国家之所以禁止EGF添加是因为EGF是单向地刺激细胞增生，甚至是无序地刺激细胞增生，一味不停地刺激细胞增生可能会导致皮肤细胞出现难于预测的问题，甚至是组织过度增生和癌变。那么外泌体（Exosomes）在调控组织再生的过程是否也存在这样的问题呢？

外泌体可显着增强组织再生，促进胶原蛋白的生成

大量研究表明，间充质干细胞的外泌体（MSC-Exo）可显着增强组织再生，促进胶原蛋白的生成。然而，MSC-Ex是否能控制干细胞在组织再生过程中的增殖，以防止组织过度增生和异常增生的问题仍有待探讨。研究发现外泌体通过调节YAP控制皮肤再生作为该信号的“刹车”，防止组织过度增生。

国际顶级行业期刊Stem cells杂志曾在线发表了我国科学家江苏大学医学院院长许文荣教授关于外泌体在调控组织再生中的相关研究工作，该研究发现人类脐带间充质干细胞（hucMSC）外泌体中14-3-3zeta可介导YAP和P-LATS结合形成一个复合物促进YAP的磷酸化，与皮肤再生过程中外泌体Wnt4信号相互协作。(Zhang, B., et al. (2016). "HucMSC Exosome-Delivered 14-3-3zeta Orchestrates Self-control of the Wnt Response via Modulation of YAP during Cutaneous Regeneration." Stem Cells.)

首先，通过评估hucMSC-Ex治疗大鼠深Ⅱ度烧伤的作用，发现hucMSC-Ex在皮肤的再生重塑阶段促进Wnt/β-catenin信号通路的自我调节。HucMSC-Ex在第4周限制过多的皮肤细胞扩张和胶原沉积。在高密度的条件下，hucMSC-Ex通过诱导YAP磷酸化抑制Wnt/β-catenin信号。

其次，hucMSC-Ex的蛋白质组学分析表明，14-3-3蛋白可以通过外泌体运输。gain-和loss-of-function的研究结果表明，hucMSC外泌体14-3-3zeta可调控YAP活力及其Ser127位点的磷酸化，这一过程需要YAP和P-LATS的相互作用。进一步研究表明，在高密度细胞状态下，14-3-3zeta招募YAP和P-LATS形成复合体，14-3-3zeta是这个复合物的关键调控分子。

这些结果综合表明，hucMSC-Ex的功能不仅可作为Wnt/β-catenin信号的“加速器”以促进受损皮肤组织的再生修复，而且可通过调节YAP控制皮肤再生作为该信号的“刹车”。

间充质干细胞外泌体在组织再生中作用和机制

组织工程利用工程学和生命科学的原理开发受损组织生物替代品, 以达到恢复、维持或改善组织功能的目的。组织再生有3个基本要素, 即干细胞、生长因子和支架。间充质干细胞( MSCs)是一类具有自我更新、多向分化和免疫调节性能的成体多潜能干细胞群, 是组织再生的重要种子细胞。但是, 越来越多的证据表明, 应用于组织再生的外源性MSCs在植入后短时间内即出现大量凋亡。此外, MSCs的应用还受到干细胞提取、运输保存等技术条件以及伦理问题等诸多限制。

19世纪80年代, PAN研究组首次发现并命名羊网织红细胞分泌的一些小囊泡为外泌体。外泌体来源于胞内体, 胞内体内陷形成多囊泡体, 多囊泡体与细胞膜结合, 释放到细胞外, 形成外泌体。外泌体直径约为40~100 nm, 电子显微镜下呈板状或杯状, 由双层磷脂分子包围而成。外泌体含有丰富的蛋白质、RNA及DNA等, 这些活性成份能够在细胞间被稳定地转运, 介导细胞之间的信息交流。

2010年, 有学者首次报道了间充质干细胞释放的外泌体(mesenchymal stem cells-derived exosomes, MSC-Exo)能提高小鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞活力, 证明了MSCs培养基中具有心肌保护功能的成分是外泌体。外泌体作为微小RNA(microRNA, miRNA)载体, 具有在细胞间传递miRNA的特性, 应用MSC-Exo治疗心肌梗死有望替代干细胞治疗。研究发现, 在体外肝损伤模型中, MSC-Exo具有低毒性和良好的细胞恢复活性, 并能减少细胞氧化应激, 发挥潜在的抗氧化作用, 而且富含生物活性分子的MSC-Exo参与肝衰竭模型损伤肝组织的修复。

（外泌体调控组织再生）

MSC-Exo外泌体源自细胞内吞途径的微膜囊泡, 是MSCs旁分泌效应的主要介导因子。MSC-Exo比单一细胞因子具有更强而复杂的信号分子转运和调控能力, 可能是干细胞发挥调控的重要途径。与细胞治疗相比, 从MSCs条件培养基中提取的外泌体具有低免疫原性, 相对更安全高效。

1 MSC-Exo通过增强细胞增殖和迁移、抑制凋亡促进组织再生

在组织再生中, MSC-Exo主要通过刺激细胞增殖, 抑制细胞凋亡, 诱导细胞活化发挥作用。研究表明, MSC-Exo能够诱导神经细胞、成熟神经元细胞和内皮细胞增殖, 减轻大脑局部的炎症反应, 修复小鼠创伤性脑损伤。MSC-Exo可以促进肝脏细胞增殖, 促进肝脏切除的小鼠肝脏组织再生。有学者发现, 与单纯的磷酸三钙(β-tricalcium phosphate, β-TCP)支架相比, 外泌体β-TCP复合支架能够更好地促进成骨分化。体外实验结果显示, 外泌体能够从β-TCP支架释放并被人骨髓干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)摄取, 被摄取到BMSCs中的外泌体能够促进BMSCs的增殖、迁移和成骨分化。基因表达谱和生物信息学分析表明, 外泌体β-TCP复合物支架显著改变了PI3K/Akt信号通路的基因表达, 而且功能性研究进一步证明了PI3K/Akt信号通路是外泌体诱导BMSCs成骨分化的分子机制所在。

人脂肪干细胞外泌体与聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)支架结合后能缓慢稳定地释放, 并提高人BMSCs在体外的成骨、增殖和迁移能力, 体内实验结果表明这种无细胞系统能显著促进骨再生, 主要与促进BMSCs在新形成的骨组织中迁移和归巢的能力有关。因此, 由人脂肪干细胞外泌体和聚多巴胺涂层PLGA支架组成的新型无细胞系统为骨组织工程提供了一种新的治疗模式, 在修复骨缺损领域具有广阔的应用前景。此外, 有学者应用miRNA-5p过表达滑膜MSCs提取的外泌体对骨关节炎进行治疗, 发现能有效提高软骨细胞的增殖和迁移能力, 同时抑制细胞外基质的分泌, 这一作用是通过Wnt信号通路介导的。

研究发现, MSC-Exo对药物性肝炎及肝损伤的修复作用是通过抑制细胞凋亡蛋白酶同时上调抗凋亡基因表达实现的。在体外实验中, 外泌体能降低小鼠肝损伤后谷草转氨酶和谷丙转氨酶的表达, 修复肝损伤; 在体内实验中, 外泌体能够诱导肝细胞由G0期重新进入G1期, 以促进细胞增殖。

2 MSC-Exo通过提高血管生成能力促进组织再生

有学者分离并鉴定了人脐带间充质干细胞的外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell exosome, hucMSC-Exo), 发现一定剂量的hucMSC-Exo能够促进内皮细胞的增殖、迁移, 从而促进血管生成。在大鼠的皮肤烧伤模型中, 一定浓度的hucMSC-Exo能够提高β-catenin在细胞核中的积聚和稳定性。用不同浓度的hucMSC-Exo处理EA.hy926细胞12 h后, PCNA和cyclin D3蛋白表达随hucMSC-Exo的剂量增加而增加; 利用shRNA沉默hucMSC中Wnt4基因后, 提取无Wnt4基因hucMSC-Exo作用于EA.hy926细胞, 发现hucMSC-Exo促血管生成作用被明显抑制, 内皮细胞标记物CD31的表达明显下调。提示Wnt4/β-Catenin信号通路在hucMSC-Exo促进伤口愈合和血管再生中发挥重要作用。

目前认为外泌体是Wnt胞外转运和分泌的潜在载体。基因表达水平测序发现Wnt5a和Wnt5b在滑膜间充质干细胞( SMSCs)中高表达, 而其他Wnt蛋白几乎不表达, 且Wnt5a和Wnt5b主要富集在SMSC-Exo中, SMSC-Exo通过Wnt信号通路提高了YAP信号分子促血管生成的活化作用。

外泌体中含有mRNA、miRNA以及各种抗凋亡和促血管生成因子, 能诱导成纤维细胞迁移、增殖及胶原合成。MSC-Exo和有机生物材料联合应用以促进愈合过程, 是一种治疗慢性伤口的新方法。此外, MSC-Exo还可以促进心脏干细胞增殖、迁移以及血管生成, 增加梗死区域毛细血管密度, 减少心肌纤维化, 从而保护心脏功能。

外泌体参与组织修复

3 MSC-Exo通过miRNA调控组织再生

miRNA是非编码单链RNA分子, 由19~25个核苷酸组成, 通过降解目的mRNA或抑制翻译引起基因沉默, 对细胞分化、增殖、凋亡、遗传调控及固有免疫和适应性免疫有重要的调控作用。作为一种新型RNA运载工具, 外泌体由于能避免内吞, 而且能快速逃避网状内皮组织系统细胞的清除, 因而拥有较高的运载效能。

大量研究证实, 外泌体能传递miRNA至靶细胞, 发挥促进组织再生作用。从兔脂肪组织中分离MSCs, 提取外泌体, 并给予结膜下和眼内注射12周后, 糖尿病家兔获得了清晰的视网膜结构。家兔血糖与视网膜组织miRNA-222表达水平呈显著负相关, MSC-Exo注射后视网膜再生与miRNA-222的表达增加相关。在大鼠心肌梗死模型中, MSC-Exo能够与MSCs同样抑制心肌纤维化和炎症。miRNA序列分析表明, MSC-Exo和MSCs有相似的miRNA表达, 这也是MSC-Exo能够代替MSCs进行心脏修复的原因之一。另外, 研究还发现一些负向调节心肌功能的miRNA, 如miRNA-130、miRNA-378、miRNA-34相对呈低表达; 而一些正向调节心肌功能的miRNA, 如miRNA-29、miRNA-24相对呈高表达。

miRNA序列分析发现, miRNA-140-5p在SMSC-Exo中呈低表达, 而过表达miRNA-140-5p的SMSC-Exo能够促进软骨细胞的增殖和迁移, 而不影响细胞外基质的分泌; miR-140-5p还能通过靶向RalA增强SOX9和聚集蛋白聚糖, 预防大鼠骨关节炎, 在软骨动态平衡和发育中扮演双重角色。

另有研究发现, 脂肪干细胞和BMSCs的外泌体miRNA表达谱高度类似, 只有极少部分转运RNA (transfer RNA, tRNA)略有不同, 推测正是这些不同的tRNA起到了关键作用。有关tRNA对外泌体组织再生作用机制的研究可能会成为新的热点。

4 MSC-Exo通过调节免疫促进组织再生

多种动物模型证明, MSC-Exo能通过局部抗炎作用修复受损组织。在小鼠急性炎症模型中, 脱落乳牙牙髓干细胞外泌体能抑制炎症引起的小鼠足部肿胀[25]。在大鼠急性心肌缺血模型中, BMSC-Exo能抑制炎症反应, 缓解心肌梗死后的纤维化, 促进血管再生, 从而提高缺血损伤后的心肌功能。

BMSC-Exo能有效地修复免疫活性大鼠模型骨软骨缺损。进一步的机制研究发现, MSC-Exo介导的软骨修复过程中, 细胞的快速增殖和浸润是由于外泌体CD73介导的丝氨酸苏氨酸激酶( AKT)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号分子腺苷激活; AKT或ERK磷酸化抑制剂可抑制外泌体介导的细胞增殖和迁移, 但不抑制基质合成; 而应用CD73抑制剂和腺苷受体拮抗剂后可导致AKT和ERK衰减, 进而证实了外泌体CD73的作用。MSC-Exo还能促进M2巨噬细胞浸润, 减少前炎性细胞因子白细胞介素( IL)-1B和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)分泌。这些均提示MSC-Exo介导的高效骨软骨再生是通过包括免疫细胞在内的多种细胞的协同动员和激活实现的。

hucMSC-Exo能够有效促进巨噬细胞从M1向M2表型的极化。体内研究表明, hucMSC-Exo通过下调炎性细胞因子, 如TNF-α、巨噬细胞炎症蛋白1α (MIP-1α)、IL-6和干扰素γ (IFN-γ), 减轻损伤区的炎症, 促进脊髓损伤后的功能恢复。

MSC-Exo是多种疾病无细胞治疗的新选择。然而, 移植后随着时间的推移, 维持体内外泌体的存留和稳定是临床应用MSC-Exo中的一个重要挑战。最近有研究发现, 壳聚糖水凝胶能显著提高人类胎盘MSCs来源外泌体中蛋白质和miRNA的稳定性, 增强外泌体的滞留和稳定性。利用萤火虫荧光素酶显像检测血管生成情况, 结果发现壳聚糖水凝胶外泌体对小鼠后肢缺血具有持久治疗作用。该研究所采用的策略有望成为评估及提高MSC-Exo治疗效果的一种简单有效的方法。

综上所述, MSC-Exo不仅携带多种传递生物学信息的RNA、DNA和蛋白, 而且能激活多种信号通路, 促进靶器官相关细胞活化、增殖, 修复损伤, 达到组织再生的目的。而且, MSC-Exo具有稳定、低免疫原性等优点, 因此已成为以无细胞为基础的、更优秀的组织再生生物治疗的新选择。