胚胎干细胞的全面发展历程

胚胎干细胞是什么？

如同许多重大生物医学的发现一样，胚胎干细胞的发现首先来自对动物的研究。1981年，英国和美国两组科研团队相继发表了分离培养小鼠胚胎干细胞的方法，首先是英国剑桥大学的马丁-埃文斯和马秀-卡夫曼(Matthew Kaufman)发表在1981年7月《自然》杂志上建立小鼠胚胎干细胞论文，同年12月加州大学的格尔-马丁在PNAS上发表的论文，马丁-埃文斯是格尔-马丁的导师，20世纪70年代初期格尔马丁在他的实验室从事博士后研究。1998年，在小鼠胚胎干细胞建立17年之后，威斯康星大学的詹姆斯-汤姆森(James Thomson)教授首次发表了建立人胚胎干细胞系的论文。

马丁-埃文斯(Martin Evans)于1941年1月1日出生在英国，1963年毕业于剑桥大学，1969年获得伦敦大学学院博士学位。1980年他开始与马修-考夫曼合作研究小鼠胚胎发育，1981年二人在学术权威杂志《自然〉上发表了小鼠的囊胚分离胚胎干细胞的方法。

格尔马丁(Gail Martin)于1971年获得美国加州大学伯克利分校的博士学位，随后赴英国伦敦大学在马丁埃文斯的实验室做博士后，当时的格尔还是一个不起眼的博士后研究员，1974年格尔-马丁发现了培养干细胞的方法。1976年格尔-马丁回美国，在美国加州大学旧金山分校任职。1981,几乎与马丁埃文斯的实验室同一时间，格尔马丁的加州实验室也发表了从小鼠胚胎组织中分离出胚胎干细胞的论文。

詹姆斯汤姆森(James Thomson)于1958年12月20日生于美国，1981年获得伊利诺伊大学生物物理学学士学位，1985年和1988年分别获得宾夕法尼亚大学兽医博士学位和分子生物学博士学位。1989—1991年汤姆森作为博士后研究员在俄勒冈国家灵长类动物研究中心，灵长类动物体外受精和胚胎实验室工作，1991—1994年在威斯康星-麦迪逊大学完成了兽医病理学住院医。1998年汤姆森首次建立了人的胚胎干细胞系，被美国《时代〉杂志誉为2001年“美国最佳科学家”。右上图是汤姆森在显微镜下观察培养的人胚胎干细胞，右下图他培养的人胚胎干细胞的显微图像。

如上所述，受精卵是人体所有细胞之祖，由其而来的胚胎干细胞可以根据它们的分化潜能，分为全能干细胞（totipotent stem cell）和亚全能干细胞[pluripotent stem cell]o全能干细胞是指受精卵最初的1~3分裂所产生的28枚细胞，这些细胞聚集成团，还没有开始分化，其中任何一个细胞都具有形成胚胎、胎盘和胎膜的能力，也就是说在适当的环境中，每一个细胞可以发育成胎儿，所以称之为全能干细胞。随着全能干细胞的分裂，细胞数目迅速增加，细胞团内出现空腔，细胞幵始初步分化，位于腔壁的细胞称为滋养层，将来形成胎盘、胎膜；位于腔内的细胞称为内细胞团，这些细胞未来生长发育成胎儿，但它们不能形成胎盘和胎膜，所以称为亚全能干细胞。用于科学研究的胚胎干细胞通常来自胚胎的内细胞团。

这里需要指出的是胚胎干细胞只存在于胚胎发育的早期阶段，随着胚胎的生长发育，全能干细胞和亚全能干细胞将迅速演变成为其他类型的细胞包括多能干细胞或单能干细胞。亚全能干细胞的英文名称是“pluripotent stem cell”，常常被翻译成多功能干细胞，但它的英文意思与“multipotent stem cell,,相差甚远，所以在此书将^pluripotent stem cell”译为亚全能干细胞，“multipotent stem ceir,译为多功能干细胞，以避免字面上混淆也更符合英文原意和二者的生物学属性。

制备胚胎干细胞需要利用人的早期胚胎，它们的制备与体外受精技术的发展密切相关。体外受精是用于治疗不孕的方法之一，在这个过程中，通常会制备数十个胚胎，从中挑选23个植入母体，剩余的胚胎可以超低温储存以备后用或者丢弃，也可以用于科学研究。研究人员将多余胚胎转移到培养皿中，把细胞分散在培养皿表面，加入培养液，放入无菌、恒温、恒湿的条件下培养为了支持人胚胎干细胞的生长，培养皿表面需要预先铺满一层小鼠的胚胎细胞，这些细胞已经被处理过，不会再分裂，它们的作用相当于胚胎滋养层细胞，供人胚胎干细胞贴附其表面，并释放营养物质进入培养液中，帮助人胚胎干细胞保持在无分化自我复制状态。当培养皿内长满人胚胎干细胞时，可以收集细胞，分放到新的培养皿中继续培养，称为传代；也可以将它们分装在冷冻管中，冻存在液氮中，需要时解冻，继续培养，这个过程称为复苏。

细胞或早期胚胎均可以超低温长期储存。通常是将细胞或胚胎放入冷冻培养液，分装到冷冻小管中，做好标记，放入液氮(-196°C)中长期储存，需要时可以取出解冻，将胚胎植入母体发育或者继续进行细胞培养。如果冻存条件适当，细胞和胚胎都可以存活数十年以上。目前对胚胎干细胞的鉴定还没有统一的标准，常用以下数种方法综合检测:

(1)长期连续培养：确定细胞能否可以长期自我复制；

(2)反复冷冻复苏：确定细胞能否持续生长；

(3)定期检测特定转录因子的表达水平：转录因子可以调控基因的开启和关闭，在干细胞的生长分化过程中起着重要作用，比如Oct4、Sox2、Nanog等；

(4)定期检测干细胞标记蛋白：因为还没有发现干细胞的特异标记蛋白，通常需要用数种标记蛋白综合检测，比如Seal、STRO-1、CD29、CD105、CD44、CD34等；

(5)定期检测分化功能：

1)自发性分化：在合适的培养条件下，胚胎干细胞可以长期处于自我复制的未分化状态，但如果让培养的胚胎干细胞聚集成团，可以诱发它们自然分化形成肌肉细胞或神经细胞等；

2)诱导性分化：在培养液中添加化学试剂或细胞生长因子可以诱导胚胎干细胞分化成为其他功能细胞，比如心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞等；

3)畸胎瘤：将胚胎干细胞接种在免疫缺陷型的裸鼠体内，它们在小鼠体内生长发育成畸胎瘤。畸胎瘤是多种组织细胞的混合物，表明胚胎干细胞可以在体内分化形成不同类型的细胞。

从人胚胎中分离培养胚胎干细胞的成功率很低，胚胎干细胞对培养条件要求非常苛刻，培养的过程中可能因为各种原因而丢失，比如微生物污染或者自然分化，因为一旦分化成其他细胞，胚胎干细胞就丧失继续自我复制的能力。如果经过多次传代后胚胎干细胞仍然保持未分化的状态，染色体没有异常变化，就可以称为胚胎干细胞系，这时就可以进行大量扩增，分批冻存，需要时可以复苏或者提供给其他实验室进行研究。

人胚胎干细胞强大的生长分化能力蕴藏着巨大的临床应用价值，如何控制胚胎干细胞输入体内后的生长分化是临床应用的关键。早期动物实验发现，植入动物体内的胚胎干细胞往往形成畸胎瘤(teratoma,图1-7),虽然可以手术切除畸胎瘤，但如果发生在大脑或心脏等重要部位，会有致命性的危险。所以研究者们非常担心胚胎干细胞输入患者体内后的命运，如果它们在体内的生长分化失控,就有导致肿瘤或者畸胎瘤，或者植入非鞄组织、形成非鞄细胞等风险。基于上述原因，目前有关人类胚胎干细胞的临床试验非常有限。科学家们希望通过更多的基础研究，阐明控制胚胎干细胞生长分化的机理，早日将它们用于治疗多种不治之症，比如：帕金森氏病、糖尿病、脊髓损伤、肌肉萎缩、心肌梗死以及视力和听力等功能性衰老退化疾病。