间充质干细胞在多发性骨髓瘤中的角色-干细胞&免疫细胞&外泌体&再生医学领域垂直媒体细胞世界

MSC和肿瘤相互作用的系列

“MSC和造血干细胞”的关系类似“土壤和种子”的关系，那么MSC在血液肿瘤中的角色如何？这是一个非常值得研究的领域。

多发性骨髓瘤（MM）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓（BM）中浆细胞克隆性增殖，血液和/或尿液中存在单克隆免疫球蛋白。BM基质细胞支持MM细胞的增殖、存活、迁移和耐药性，以及破骨细胞生成和血管生成。

健康的间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）具有很强的成骨分化能力。多发性骨髓瘤又是以骨破坏为明显的临床表现。那么自身骨髓里面的MSC为何不能通过向成骨细胞分化来减少或修复骨破损？

MSC构成了BM基质的主要细胞，也参与了MM的病理生理学和进展。因而，MM患者来源的MSC（MM-MSC）与正常供体来源的MSC（ND-MSC）在基因和功能上似乎有所差异。

1，MM患者骨髓MSC出现病理性异常

骨髓MSC是BM微环境形成和功能的重要组成细胞类型。虽然MM-MSC的表面免疫表型与ND-MSC相似^[1]，但是MM-MSC的功能出现一些病理性改变，即MM-MSC受伤了。

（1）MSC的增殖功能受损

MM-MSC表现出衰老相关β-半乳糖苷酶表达增加、细胞大小增加、增殖能力降低以及衰老相关分泌谱成员的特征性表达^[2-4]。也有研究显示骨髓MSC的增殖能力在正常供体、意义未明的单克隆免疫球蛋白增多症（MGUS）患者和MM患者中没有差异^[5]。

MM-MSC的增殖能力远低于ND-MSC，很可能与MSC细胞表面的重要生长因子受体表达减少有关^[6]。但也有研究表明MM-MSC比健康者MSC表达更高的生长因子（bFGF、HGF、和VEGF）^[7]。

溶血磷脂酸（LPA）信号能决定MSC的功效，LPA受体3基因沉默的MSC在体外表现出细胞衰老相关表型，并在体内显著促进MM和肿瘤相关血管生成的进展，LPA受体1基因沉默的MSC则在体外表现出抗衰老特性，并在体内有效地延缓了MM和肿瘤相关血管生成的进展^[8]。

韩国某实验室发现有35%的患者骨髓MSC未能在体外培养增殖，有50%的骨髓MSC在第6代时出现细胞增殖停止；增殖能力下降的骨髓MSC显示CDKN2A过表达和CXCL12下调，在CDKN2A基因敲除后，患者的骨髓MSC恢复了高增殖活性^[9]。面对这样的实验结果，需要考虑这个实验室的MSC培养技术是否过关。

（2）MSC向成骨细胞分化减弱

MM是所有恶性疾病中骨受累发生率最高的疾病。MM的骨病以溶骨性病变为特征，可导致严重骨痛、病理性骨折和高钙血症。和健康人骨髓MSC相比，MM患者的骨髓MSC的分化能力出现损伤^[10]。与没有骨损伤的患者相比，有溶骨性损伤的MM患者的骨髓活检中关键成骨细胞转录因子Runx2/Cbfa1阳性细胞的数量显著减少，这表明Runx2/Cbfa1在MM骨形成减少中起着关键作用^[11]。

作为成骨细胞的祖细胞，来自MM患者（而非MGUS患者）的MSC与来自正常供体的MSC相比，显示出显著降低的成骨分化潜能^[12]。与MGUS患者的浆细胞和正常浆细胞相比，MM细胞过度表达多种Wnt抑制剂^[13-15]。除了Wnt信号抑制剂外，还发现了一些其他的细胞因子参与了MM细胞介导骨髓MSC向成骨细胞分化的抑制，比如IL-7^[11]、IL-3^[16]、激活素A^[17]等。相反，MM-MSC向脂肪细胞分化得到增强^{[18, 19]}。

（3）MSC分泌细胞因子谱异常

MM患者的MSC过度表达生长分化因子15（GDF15）^[5]，GDF15有助于骨髓瘤细胞的生长和化疗耐药性，而且高水平的GDF15与MM患者的不良预后相关^[20]。骨髓瘤细胞分泌的bFGF与骨髓MSC上的bFGF受体结合，从而刺激IL-6的产生^[21]。MM-MSC比健康者骨髓MSC表达更高的TGF-β1、IL-6、IL-3、TNF-α和RANKL，但是TGF-β2、TGF-β3和FasL的表达降低，伴随着对T细胞增殖的抑制作用减弱^[22]。

与对照组相比，MM患者骨髓MSC和骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞共培养后，骨髓MSC分泌更多的IL-6、IL-10、TNF-α、OPN，尤其是HGF和BAFF的浓度更高，而且MM患者骨髓MSC显著增强了RPMI8226细胞产生的sIL-6R^[23]。需要注意的是，这篇文章所用的骨髓MSC纯度不高，因为对照组MSC的CD14表达高达9.8%，MM患者骨髓MSC的CD14表达更是达到了13.1%，而人MSC的定义要求CD14的表达不超过2%^[24]。

也有研究显示MM来源的MSC的增殖和IL-6分泌与健康者骨髓MSC没有差异，但是MM-MSC在TLR-2激活后IL-8分泌和信号通路分子ERK1/2磷酸化方面存在缺陷^[25]。MM-MSC表达更高的IL-8，IL-8增强了MM细胞的NF-κB活性，导致了MM细胞对硼替佐米的耐药^[26]。MM细胞诱导骨髓MSC高表达多种分子，从而形成更有利于其生存的BM微环境^[27-31]。

MM-MSC的端粒长度和IL-6和MIP-1α的mRNA表达明显长于或高于对照组，而且MM-MSC点端粒长度和IL‑6和MIP‑1α的mRNA水平表达呈正相关^[32]。

MM-MSC免疫调节能力的下降与其免疫原性和分泌谱的变化有关，伴随着IL-6表达增强和IL-10的分泌减少，以及CD40/40L、VCAM1、ICAM-1、LFA-3、HO-1、HLA-DR和HLA-ABC的异常表达^{[33, 34]}。

（4）基因表达异常

需要注意的是，不同的研究小组在研究对比MM-MSC和N-MSC的基因表达差异时，发现表达差异的基因数量不一样。

通过流式分选技术，发现新诊断的活动期MM患者骨髓中MSC的数量多于健康人群骨髓MSC的数量（含量0.028%比0.0038%）；MM-MSC和ND-MSC之间有606个基因出现表达差异；但是不管是MM患者还是健康人，增殖培养的MSC的基因转录组表达谱不同于新鲜分离的MSC^[10]。与正常对照组相比，培养的MM-MSC显示出不一样的阵列比较基因组杂交图谱^[35]。

N-MSC和MM-MSC之间有78个差异表达基因，但是这个研究还需要考虑到基因表达的个体差异；对比非溶骨性患者MM-MSC，溶骨性患者MM-MSC出现相关的独特转录模式，有35个基因上调和9个基因下调^[36]。也有研究发现MM-MSC与ND-MSC具有485个差异表达基因，其中MM-MSC有280基因转录上调，205个下调；下调的差异基因主要与细胞周期进展、免疫应答激活和骨代谢有关^[37]。

基于阵列的比较基因组杂交（阵列CGH）分析，比较体外培养扩增后来自21名骨髓瘤患者MM-MSC和12名正常供体ND-MSCs的不平衡基因组改变的程度；ND-MSC没有检测到基因组失衡，但在MM-MSC中检测到一些非复发性染色体增加和丢失（>1Mb大小）；但是作者认为所有MM-MSC在的基因组改变方面均属于细胞遗传学的正常变化^[35]。因此，有专家认为尽管ND-MSC和MM-MSC之间可能存在染色体畸变，但它们不能解释观察到的大多数功能和基因表达差异^[38]。然而，MM-MSC的这些基因表达异常能够在多大程度上影响MM疾病的进展或复发仍有待确定。

基于三个MSC特异性基因COL4A1、NPR3和ITGBL1确定了一个独立的预后基因风险提示指标，这三个基因能够预测多发性骨髓瘤患者的无进展生存率和从SMM进展为多发性骨髓瘤，COL4A1的高表达与高风险相关，而NPR3和ITGBL1的低表达与低风险相关^[39]。

自不同MM阶段的骨髓MSC出现广泛DNA甲基化改变，特别是在与异常表达相关的成骨分化相关的Homeobox基因，而小分子抑制剂CM-272的药理学靶向可恢复高甲基成骨调节因子的表达，并促进MM-MSC的成骨细胞分化，从而靶向性逆转骨髓瘤相关骨病^[40]。

有意思的是，不同于MM患者骨髓MSC出现明显的病理性异常改变，MM患者脂肪MSC和健康供体脂肪MSC在转录组、表型和功能方面没有出现明显异常改变^[41]。

2，MM细胞和MSC的相互影响

MSC通过产生高水平的IL-6（一种主要的MM细胞生长因子）来强烈支持MM细胞的生长^{[42, 43]}。但是，如果在没有MSC的情况下，用IL-6受体拮抗剂Sant7或抗gp130单克隆抗体会诱导MM细胞凋亡；相反，如果MM细胞与MSC共培养，则不能观察到MM凋亡^[44]。只有IL-6R/STAT3和MEK1,2/ERK1,2通路的联合破坏，才能导致即使在MSC存在的情况下也强烈诱导MM细胞凋亡^[45]。

MM细胞通过CCL25趋化吸引MSC，借助于细胞表面Connexin-43 (Cx43)蛋白与MSC相互接触交流，从而促进MM细胞生长，MM与MSC相互交流后导致MSC上调IL-6、IL-10、IGF-1、VEGF和dickkopf homolog 1的表达^{[28, 46]}。骨髓MSC还可以通过释放的外泌体来促进MM细胞的增殖和疾病的进展^[47-50]。除了细胞因子之间的交流，MSC亦通过PD-1/PD-L1途径抑制T细胞反应，从而促进MM细胞增殖和疾病进展^[51]。

MM细胞分泌Wnt抑制剂Dickkopf-1（DDK1），阻止MSC分化为成骨细胞^[43]。MM细胞和MM-MSC共培养，导致MM-MSC低表达miR-223，而miR-223的低表达反而促进了VEGF and IL-6的分泌，同时抑制了MSC的成骨分化^[52]。MM-MSC高表达miR-135b也同样损害了MSC向成骨细胞分化的能力^[53]。

骨髓MSC和MM细胞直接相互接触，MSC表达的抗凋亡基因抗凋亡蛋白Survivin、Mcl-1和XIAP可以保护MM细胞免受CART细胞的杀伤攻击，从而导致CART一定程度上的耐药^[54]。骨髓MSC和MM细胞直接相互接触后，骨髓MSC向MM细胞输送线粒体，降低胞内超氧化物水平，促进了MM细胞的耐药^[55]。

MM患者的血浆中有七种细胞因子（ANG1、ENA-78、EGF、PDGF-AA/AB/BB和TARC）的含量升高，这些因子脂肪MSC上调脂肪分化的关键基因PPARγ的表达，同时抑制了成骨细胞分化^[19]。

3，小结

有研究发现MSC能抑制MM的增殖^[56]。健康的MSC能有效抑制体内的骨破坏、提高骨密度和MM肿瘤细胞生长，尽管这些MSC在体外显著支持MM细胞生长^{[57, 58]}。与骨髓来源的MSC相比，脂肪组织来源的MSC和脐带来源的MSC在体外和体内显著抑制MM细胞克隆形成和生长，该研究者提出脐带MSC与其他MSC相比具有独特的分子特征^[59]。但也有一些报告显示MSC对MM细胞的生长没有显著影响^[60]。在MM疾病动物的实验研究中，经过基因改造的MSC可减少破骨细胞的激活和小梁骨丢失，显示出较强的抗肿瘤效果^[60-62]。

常见治疗的化学药物中，沙利度胺（100μM）可以降低了骨髓MSC的IL-6和VEGF表达量^[63]。如果用CXCR4抑制剂AMD3100阻断MSC和MM细胞的相互接触，则可以增加药物对MM细胞的敏感性^{[64, 65]}。也有研究显示，与骨髓MSC的共培养，并不影响美氟芬、美法仑、硼替佐米和多柔比星对MM细胞的细胞毒性；而美氟芬对MSC的脂肪生成、成骨分化和促进血管生成都有影响^[66]。

总的来说，健康的MSC可以被认为是一种可能的治疗工具，或MM患者骨髓的MSC成为一个治疗的靶点。

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