通过“时光机器”连接干细胞命运和基因表达

干细胞和前体细胞的分化路径在单细胞层面存在差异，单个干细胞在分化为不同成熟细胞的过程有着不同的偏好。实验证明这种命运偏好并不是完全随机或只受胞外信号的影响，也同细胞内的状态有关【1】。近年来发展迅速的单细胞测序技术极大的扩展了我们对于干细胞转录组异质性的了解。由于单细胞测序具有破坏性，以及干细胞的基因表达和随后的分化发生在不同的时间。除非时光倒流，对一个干细胞进行测序之后，它的分化路径不得而知。树突状细胞（dendritic cells，DC）联系体内先天性免疫和适应性免疫，主要包括1型/2型常规树突细胞 (type 1/2 conventional DC，cDC1，cDC2)，和浆细胞样树突细胞（plasmacytoid DC, pDC）【2】。不同类型的DC如何由造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）分化及调控是尚未被完全解答。造血干细胞在转录组层面的异质性，是否和不同类型DC的命运偏好有关？

为了解决这一问题，2021年4月15日，澳大利亚的Shalin Naik团队在Immunity发表了Clonal multi-omics reveals Bcor as a negative regulator of emergency dendritic cell development ，通过分离分化早期的姐妹细胞并分别进行测序和功能检验，将细胞命运和干细胞的基因表达这一发生在不同时间的现象关联到了一起。研究使用从造血干细胞到树突状细胞的体外分化系统作为例子，关联了造血干细胞转录组异质性和不同的DC命运偏好。并进一步通过CRISPR筛选并验证了Bcor作为cDC2和pDC的负调控基因，同时揭示了Bcor在抑制cDC2和pDC分化上扮演的不同作用。

作者首先探究了FLT3L介导的造血干细胞分化早期（day 2.5-4.5）的姐妹细胞，最终分化为三种不同DC的能力，并且发现了来自同一造血干细胞的姐妹细胞，其分化路径的偏好高度一致。例如某个来自同一个造血干细胞的姐妹细胞都具有强烈的cDC2偏好，而较少分化为cDC1和pDC。姐妹细胞命运偏好的相似性，使得它们可以被分离成多组，一部分细胞进行转录组测序而另一部分细胞继续进行体外分化（SIS-seq）。在对多个造血干细胞的姐妹细胞进行独立的分离和测序后，作者使用了带有正则化的广义线性模型来寻找干细胞基因表达和命运偏好的关联，并且筛选出超过400个基因。其中包括多个已知的调控DC分化的基因，例如Id2，Batf3，Irf4等，从侧面证明了这一方法在发现调控干细胞命运的基因上的作用。不仅如此，筛选出的列表中还包含了大量未经报道的基因。例如高表达Bcor的干细胞，其姐妹细胞会更多的分化为cDC1而不是cDC2和pDC。

为了进一步验证这些基因的调控功能，作者使用CRISPR对这些基因进行高通量筛选，并且确认了多个调控DC分化的新基因。其中，敲除了Bcor的造血干细胞会大量分化为cDC2和pDC，但是cDC1的数量并没有显著的增加，和之前的实验一致。与此同时，作者还发现了敲除Bcor会增加疑似DC的前体细胞（pre-DC）。为了更好的在单细胞层面刻画Bcor敲除对转录组的影响，作者同时对Bcor敲除后DC分化路径上的细胞以及空白对照进行了单细胞测序。在数据整合之后，敲除了Bcor的成熟细胞cDC1，cDC2和pDC的关键marker表达类似。同时实验表明敲除Bcor之后分化出的成熟DC细胞依然可以行使其功能，说明Bcor可能并不影响成熟DC。虽然成熟细胞的基因表达类似，Bcor敲除后的干细胞分化出大量的前体细胞。通过和已知数据库Immgen的比对，发现这些前体细胞的转录组和造血干细胞的不同分化时期类似（MPP，CDP，CLP）。结合多个实验的结果，Bcor敲除后的干细胞会生成大量的DC前体细胞，并且这些细胞具有cDC2和pDC的分化偏好。在体内实验中，作者发现，Bcor在稳态下并不影响DC分化的命运选择，只有在FLT3L刺激的体内环境下才会明显增加cDC2和pDC的数量，说明Bcor对cDC2和pDC的调控是依赖于FLT3L的。

尽管Bcor敲除对cDC2和pDC的正调控作用已经得到了确认，但是在单个干细胞克隆层面，这种调控可能有多种表现形式。例如，本来缺乏cDC2和pDC的分化能力，命运偏向cDC1的干细胞在敲除Bcor后获得了cDC2和pDC的分化能力（fate gain），亦或是本来就可以生成三种DC的干细胞，在敲除后，cDC2和pDC的分化路径得到了加强，细胞数量扩增（clonal expansion）。使用类似的思路，作者在造血干细胞中加入DNA条形码进行谱系示踪，并使用来自同一造血干细胞的姐妹细胞分开进行实验，对一部分细胞敲除Bcor，另一部分细胞作为空白对照，来探究Bcor对干细胞自身的细胞命运决定有什么影响（SIS-skew）。实验结果显示，pDC的细胞数量增加，主要来自fate gain，也就是本来缺乏pDC分化能力的细胞可以分化为pDC。而cDC2的细胞数量增加主要来自于clonal expansion，即原来就可以分化cDC2的干细胞，其分化繁殖能力得到了加强。该试验进一步揭示了Bcor在调控不同DC分化上的功能差异。

总的来说，文章提供了一种研究干细胞分化的一般思路，来关联干细胞状态和其分化路径。该方法不仅局限于转录组，也可以通过将姐妹细胞分离为多组，来对其进行克隆层面的多组学研究，或是在多个时间点进行分离，研究动态的分化轨迹【3】。也可以使用可表达的DNA条形码，同时标记多个造血干细胞并分离姐妹细胞来增加通量【4】。田鲁亦，Sara Tomei, Jaring Schreuder为本文的共同第一作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.03.012

参考文献：

1. Naik, S., Perié, L., Swart, E. et al. Diverse and heritable lineage imprinting of early haematopoietic progenitors.Nature 496, 229–232 (2013). https://doi.org/10.1038/nature12013

2. Shortman, K., Liu, YJ. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol 2, 151–161 (2002). https://doi.org/10.1038/nri746

3. Lin, D.S., Tian, L., Tomei, S. et al. Single-cell analyses reveal the clonal and molecular aetiology of Flt3L-induced emergency dendritic cell development. Nat Cell Biol 23, 219–231 (2021). https://doi.org/10.1038/s41556-021-00636-7

4. Weinreb C, Rodriguez-Fraticelli A, Camargo FD, Klein AM. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation. Science.2020;367(6479):eaaw3381. doi:10.1126/science.aaw3381